Teknik molekuler

Sekarang ini penggunaan metode molekuler telah sangat luas untuk analisis sel dan penentuan urutan nukleotida dari keseluruhan genom. Pengetahuan mengenai aktivitas DNA polymerase, enzim restriksi dan DNA ligase melahirkan teknik-teknik kloning DNA dan PCR (polymerase chain reaction) yang memungkinkan diisolasinya segmen DNA. Para ilmuwan juga telah mengembangkan alat dan metode untuk memurnikan protein dan meneliti fungsinya.

DNA

Isolasi DNA

DNA adalah molekul yang terdapat pada semua mahluk hidup. Molekul ini sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata. Tetapi DNA dapat diekstrak dari ribuan sel sehingga DNA dapat terlihat karena jumlahnya yang sangat banyak. Tahapan dalam ekstraksi DNA adalah pemecahan sel, keluarnya DNA dari nukleus dan pengendapan/presipitasi DNA. Ekstraksi DNA memiliki banyak aplikasi praktis, diantaranya adalah untuk tujuan pemuliaan, evolusi, sitematik, konservasi, dll.

Dalam ekstraksi DNA tumbuhan, metode ekstraksi yang sering digunakan adalah berdasarkan Doyle dan Doyle 91989). Metode ini menggunakan buffer ekstraksi yang terdiri dari

Elektroforesis DNA

Pemisahan DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel. Molekul DNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel dengan aliran listrik. DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif (Gambar 1). Molekul yang berukuran besar, memiliki kesulitan melewati pori-pori gel sehingga bermigrasi lebih lambat melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. Setelah elektroforesis selesai, molekul DNA divisualisasi dengan pewarna fluorescent seperti ethidium yang berikatan dengan DNA dan berada di antara basa-basa DNA.

Gambar : Elektroforesis DNA dengan gel agarosa

Dua alternatif macam gel adalah poliakrilamida dan agarosa. Poliakrilamida memiliki kapasitas resolusi yang lebih tinggi, tetapi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit. Jadi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA satu sama lainnya yang berbeda ukurannya hanya beberapa atau bahkan satu pasang basa saja tetapi pada molekul yang berukuran beberapa ratus pasang basa saja (dibawah 1000 pasang basa). Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih rendah tetapi dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa.

DNA yang berukuran sangat panjang tidak dapat melewati pori gel bahkan pori gel agarosa. DNA yang sangat besar melewati matriks dengan satu ujung bergerak lebih dulu sedang ujung lainnya mengikuti. Akibatnya DNA diatas ukuran tertentu (30 -50 kb) bermigrasi dengan jarak yang sama sehingga tidak dapat diamati pemisahannya. DNA yang sangat panjang ini dapat dipisahkan satu sama lainnya dengan jika daerah listrik diaplikasikan dalam ‘pulses’ yang berasal secara orthogonal satu sama lainnya. Teknik ini disebut pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) (Gambar di bawah).

Gambar : Pulsed field gel electrophoresis

Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan RNA. Seperti juga DNA, RNA memiliki muatan negative, tetapi molekul RNA merupakan molekul utas tunggal dan memiliki struktur sekunder atau tersier. Untuk mengatasinya, RNA diberi perlakuan dengan glyoxal yang bereaksi dengan RNA sehingga menghalangi pembentukan pasangan basa. RNA yang ter-glyoxylasi tidak dapat membentuk struktur sekunder atau tersier sehingga dapat bermigrasi dengan mobilitas yang proporsional terhadap ukurannya. Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan protein dengan prinsip yang sama.

Pemotongan DNA dengan enzim restriksi

Kebanyakan molekul DNA dalam sel berukuran lebih besar dari yang diperlukan untuk analisa DNA di laboratorium. Jika akan mempelajari gen secara individual atau mempelajari situs individual pada DNA, molekul DNA berukuran besar di dalam sel harus dipotong ke dalam fragmen-fragmen yang lebih kecil. Pemotongan DNA ini dilakukan dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi. Nuklease ini adalah enzim yang memotong DNA pada tempat tertentu dengan cara mengenali urutan basa yang spesifik (Gambar 3).

Enzim restriksi yang digunakan dalam biologi molekuler umumnya mengenali urutan basa yang pendek (4-8 bp) dan memotong pada posisi tertentu yang telah ditentukan dalam urutan sekuens DNA tersebut. Contohnya adalah enzim EcoRI yang ditemukan pada strain Escherichia coli dan merupakan enzim restriksi yang pertama (I) ditemukan pada spesies ini. Enzim ini mengenali urutan DNA 5′-GAATTC-3′.

Gambar : Situs pengenalan enzim restriksi

Jika molekul DNA yang sama dipotong dengan enzim restriksi yang berbeda, misalnya oleh HindIII yang mengenali urutan 6pb (5′-AAGCTT-3′), atau dipotong dengan EcoRI, maka molekul DNA dipotong pada posisi yang berbeda dan menghasilkan fragmen dengan ukuran yang berbeda (Gambar 4). Jadi sebuah molekul akan menghasilkan sebuah seri karakteristik pola pemotongan DNA saat dipotong dengan satu set enzim restriksi yang berbeda.

Gambar : Pemotongan DNA dengan EcoRI menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran yang bervariasi

Enzim restriksi jenis lain seperti Sau3A1 yang ditemukan pada bakteri Staphylococcus aureus mengenali sekuens teramerik (4bp) dengan urutan 5′-GATC-3′ sehingga enzim ini memiliki frekuensi yang lebih tinggi dalam memotong DNA, kira-kira satu kali dalam 250bp. Di sisi lain terdapat enzim retriksi yang mengenali sekuens oktamerik (8 bp) yaitu enzim NotI yang mengenali uruta 5′-GCGGCCGC-3′ dan rata-rata memotong hanya sekali dalam 65 kb.

Enzim restriksi tidk hanya berbeda dalam urutan basa yang dikenali, tetapi juga pada pada struktur hasil produk pemotongannya. Beberapa enzim seperti HpaI menghasilkan produk dengan ujung tumpul, enzim lain seperti EcoRI, HindIII dan PstI menghasilkan ujung lengket (Gambar di bawah).

Gambar : Ujung lengket dan ujung tumpul yang merupakan hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi

Hibridisasi DNA untuk mengidentifikasi molekul DNA yang spesifik

DNA yang telah terdenaturasi memiliki kapasitas untuk bergabung kembali (untuk membentuk kembali pasngan basa di antara utas komplementer). Hal ini menyebabkan terjadinya pembentukan molekul hybrid saat homolog, DNA yang terdenaturasi dari dua sumber yang berbeda bercampur satu sama lain dalam kondisi yang sesuai kekuatan ion dan temperaturnya. Proses perpasangan basa antara polinukleotida utas tunggal yang komplementer disebut hibridisasi.

Banyak teknik yang tergantung pada ke-khas-an hibridisasi antara dua molekul DNA dari sekuens yang komplementer. Sebagai contoh, hibridisasi merupakan dasar untuk mendeteksi sekuens spesifik dalam campuran asam nukleat yang kompleks. Dalam hal ini, satu molekul adalah ‘probe’ dari sekuens tertentu (dapat berupa sekuens yang dimurnikan atau molekul DNA yang disintesis secara kimia. Probe digunakan untuk mencari molekul yang memiliki sekuens komplementer dalam campuran DNA. DNA probe harus dilabel, sehingga dapat dengan mudah diketahui lokasinya saat telah menemukan sekuens targetnya. Campuran yang telah ter=probe dipisahkan berdasarkan ukuran pada gel atau didistribusikan sebagai perpustakaan klon (library of clones) Gambar 6.

Misalnya genom yeast dipotong dengan enzim EcoRI dan peneliti ingin mengetahui ukuran fragmen DNA yang mengandung gen yang diinginkan. Saat diwarnai dengan etidium bromida, ribuan fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan genom yeast dengan enzim restriksi berjumlah terlalu banyak sehingga tidak dapat dipisahkan menjadi ‘band’ DNA yang terpisah. Mereka tampak ‘smear’. Teknik yang dianamakan Southern blot hybridization akan mengidentifikasi ukuran dari fragmen tertentu di antara smear DNA. Gel edirendam dalam larutan alkamli untuk mendenaturasikan double heliks. Fragmen ini kemudian ditransfer dari gel ke membrane yang bermuatan positif tempat DNA akan terikat. Setelah DNA tertransfer pada membran, membran diinkubasi dengan probe yang mengandung sekuens DNA komplementer dengan sekuens yang diinginkan. ‘Probing’ dilakukan dalam kondisi konsentrasi garam dan temperature dekat dengan kondisi denaturasi dan reanturasi asam nukleat. Dalam kondisi ini DNA probe akan berhibridisasi dengan kuat hanya dengan komplementer yang tepat.

Media film atau media yang sensitif terhadap cahaya atau elektron yang dikeluarkan oleh DNA yang dilabel dapat mendeteksi lokasi probe berhibridisasi. Saat X-ray film diekspos ke filter dan di-develop, maka akan menghasilkan autoradiogram dengan pola terekspos sama dengan lokasi hybrid (Gambar di bawah).

Gambar : Hasil probing DNA

Kloning DNA

Kemampuan molekul DNA membentuk rekombinan dan menjaganya dalam sel disebut kloning DNA. Proses ini melibatkan vektor yang menjadi sarana DNA untuk memperbanyak klon DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vector. Kunci untuk menghasilkan molekul DNa rekombinan adalah enzim restriksi yang memotong DNA pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang terpotong dengan DNA lain. Dengan menghasilkan molekul DNA rekombinan yang dapat diperbanyak pada organisme inang, fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar.

Kloning DNA dalam plasmid vektor

DNa dipotong dengan enzim restriksi, kemudian dimasukkan ke dalam vektor untuk diperbanyak. Inang (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak DNA adalah bakteri E. coli.

Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu:

1. Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang memungkinkan DNA bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang.

2. Mengandung marker selektif yang menyebabkab sel yang membawa vector (termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi

3. Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi. Hal ini menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya.

Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular disebut plasmid. Molekul ini biasanya ditemukan pada banyak bakteri. Pada banyak kasus, DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika.

Memasukkan fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang mudah. Misalnya plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI, maka vector disiapkan dengan memotongnya dengan Eco RI. Potongan DNA yang akan diklon kemudian disambungkan dengan bantuan DNA ligase (Gambar di bawah).

Gambar : Kloning DNA dalam plasmid vektor

Vektor dapat dimasukkan ke organism inang melalui transformasi

Transformasi merupakan proses dimana organisme inang mengambil DNA dari lingkungan. Beberapa bakteri, tetapi bukan E. coli dapat mengambil DNA secara alami dan dikatakan memiliki kompetensi genetik. E. coli dapat bersifat kompeten mengambil DNA melalui perlakuan dengan ion kalsium. Antibiotika kemudian ditambahkan dalam medium untuk menyeleksi pertumbuhan sel yang mengambil DNA plasmid - sell ini disebut transforman. Sel yang membawa plasmid akan dapat tumbuh pada medium, sedang yang tidak membawa plasmid, tidak dapat tumbuh (Gambar 7).

Perpustakaan molekul DNA (DNA library) dapat dihasilkan melalui cloning

Perpustakaan DNA merupakan populasi vector identik yang masing-masing berisi insert yang berbeda. Untuk membuat perpustakaan DNA, DNA target dipotong dengan enzim restriksi yang memberikan ukuran rata-rata insert yang diinginkan. Ukuran insert dapat berkisar kurang dari 100 bp sampai lebih dari satu megabase. DNA yang telah terpotong selanjutnya dicampurkan dengan vector yang sesuai (yang dipotong dengan enzim restriksi yang sama) dan ditambah ligase. Hal ini menghasilkan koleksi vector dengan insert DNA yang berbeda (Gambar di bawah).

Gambar : Pembentukan DNA library

Berbagai perpustakaan DNA dapat dihasilkan dengan menggunakan insert dari berbagai sumber. Perpustakaan DNA yang paling sederhana dihasilkan dari DNA genomik total yang disebut dengan ‘genomic libraries’.

‘cDNA library’ dikembangkan untuk memperkaya ‘coding sequences’ dalam library. cDNA library dibuat dengan menggunakan mRNA yang dikonversi menjadi DNA. Proses ini disebut reverse transcription yang dilakukan oleh enzim reverse transcriptase . Saat diberi perlakuan dengan reverse transcriptase, mRNA dikonversi menjadi kopi DNA utas ganda yang disebut cDNA (copy DNA).

Selanjutnya, proses pembentukan library sama dengan pembentukan library pada DNA genomic. cDNA dan vector diberi perlakuan dengan enzim restriksi yang sama dan fragmen-fragmen hasilnya disambungkan ke dalam vector.

Gambar : Pembentukan cDNA

Hibridisasi digunakan untuk mengidentifikasi klon spesifik dari sebuah library

Identifikasi fragmen dari sebuah gen di antara klon-kon dapat dilakukan dengan menggunakan DNA probe yang urutan DNAnya sesuai dengan sebagian dari urutan DNA gen yang diinginkan. Proses penggunaan probe dengan DNA yang dilabel digunakan untuk melakukan screening terhadap library disebut colony hybridization.

cDNA library akan memiliki ribuan insert yang berbeda dan masing-masing terdapat dalam vektot umum. Setelah transformasi ke dalam bakteri khusus yang cocok sebagai inang, sel ditumbuhkan dalam cawan petri dalam media agar. Tiap sel akan tumbuh menjadi koloni dan tiap sel dalam koloni mengandung vector yang sama dan insert dari library,

membrane filter dengan positive charge digunakan untuk probing. Membran ditekan di atas koloni dan cetakan koloni aakan berada pada membrane. Selanjutnya dilakukan probing terhadap filter. Filter yang mengandung sel diberi perlakuan yang memecah sel dan mengeluarkan DNA yang kemudian terikat pada filter pada lokasi yang sama dengan sel. Filter selajutnya diinkubasi dengan probe.

PCR (polymerase chain reaction)

PCR adalah sebuah teknik biologi molekuler untuk mereplikasikan DNA dengan menggunakan enzim Taq polimerase. PCR digunakan untuk mengamplifikasi bagian DNA yang pendek (sampai 10 kb). Sejak ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983, teknik ini telah melahirkan teknik PCR-based marker teknik lainnya yang sangat bervariasi. Protokol dasar PCR adalah:

I. DNA utas ganda didenaturasi pada suhu 95C sehingga membentuj DNA utas tunggal yang berfungsi sebagai cetakan.

II. DNA utas tunggal yang pendek (disebut primer) berikatan dengan DNA cetakan pada temperature rendah. Ikatan preimer terjadi pada utas yang komplementer dengan cetakan pada daerah ujung batas sekuen DNA target.

III. Suhu ditingkatkan menjadi 72C sehingga enzim DNA polymerase dapat melakukan sintesis DNA membentuk utas ganda DNA baru.

IV. Utas ganda DNA yang baru disintesis, didenaturasi pada suhu tinggi dan siklus berulang.

Gambar di bawah menunjukkan proses PCR. Produk PCR diamati dengan gel elektroforesis dengan menggunakan gel agarose ataupun gel poliakrilamida dan diamati dengan uv-transiluminator.

Gambar : Proses PCR