Faktor Penentu Keberhasilan Analisa DNA sequencing

Sequencing DiagramAnalisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam mengungkap rahasia genetik di balik kehidupan. Banyak sekali penelitian life science yang melibatkan analisa ini. Pencapaian terbesar teknologi DNA sequencing saat ini adalah terungkapnya urutan basa nukleotida yang menyusun genom manusia. Para peneliti yang menggunakan tools ini seringkali menghadapi masalah dalam melakukan analisa, output yang dihasilkan seringkali tidak memuaskan. DNA sequencing menggunakan elektrophoresis kapiler merupakan teknologi kunci pada laboratorium-laboratorium life science. Berikut ini adalah beberapa hal yang penting untuk diketahui yang menjadi faktor penentu keberhasilan analisa DNA Sequencing.

Ekstraksi DNA untuk DNA sequencing

Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sample.
Desain Primer dan Amplifikasi

Urutan kerja DNA sequencing secara umum mengharuskan kita mengamplifikasi hasil ekstraksi DNA sample sebelum disekuen. Untuk mengamplifikasi DNA sample, kita membutuhkan DNA polymerase, nukleotida (dNTP), buffer reaksi, primer dan sebuah thermal cycler.
Sequencing Chemistries

Cycle sequencing merupakan metode sederhana yang mana terdiri atas proses denaturasi, annealing dan ekstensi yang berulang-ulang dalam sebuah mesin thermal cycler, menghasilkan amplifikasi linear produk-produk ekstensi. Produk ini kemudian diinjeksikan ke dalam sebuah kapiler. Untuk Applied Biosystems, ada 2 kategori pendekatan sequencing chemistry: Dye Primer Chemistry dan Dye Terminator chemistry.






Gambar 1: Cycle Sequencing

Sequencing menggunakan Dye Primers

Ketika menggunakan sequencing chemistry berbasis dye primer, dilakukan empat reaksi terpisah. Setiap reaksi dilabel pada ujung 5′-nya dengan menggunakan dye fluorescent yang berbeda. Masing-masing keempat reaksi ini akan mengandung apakah primer yang dilabel warna biru, hijau, kuning atau merah. Warna setiap reaksi berkorespondensi dengan A, C, G atau T. Dideoksiribonukleotida (ddNTP) terdapat dalam setiap campuran reaksi, dan menterminasi sintesis DNA secara acak, menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi. Karena digunakan primer yang dilabel fluorescent untuk ekstensi, seluruh fragmen yang diterminasi terlabel fluorescent. Setelah beberapa siklus yang cukup untuk terbentuknya produk ekstensi yang optimal, keempat reaksi tersebut digabungkan dan dielektroforesis menggunakan satu kapiler pada mesin Genetic Analyzer (gambar 2).











Gambar 2: Satu siklus dye primer cycle sequencing

Sequencing menggunakan Dye Terminators

DNA sequencing fluorescent dapat juga dilakukan menggunakan suatu bahan kimia dimana pewarna (dye) terikat pada ddNTP, sehingga membutuhkan hanya satu tabung reaksi per sample, bukan empat. Karena hanya membutuhkan satu tabung reaksi untuk reaksi dye terminator, bahan kimia ini lebih simple untuk digunakan dibanding dye primer chemistry. Template DNA, primer tak dilabel, buffer, empat jenis dNTP, empat jenis ddNTP yang terlabel fluorescent, dan DNA polymerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Fragmen-fragmen yang berfluorescent terbentuk karena inkorporasi ddNTP yang terlabel pewarna. Masing-masing ddNTP yang berbeda (ddATP, ddCTP, ddGTP, atau ddTTP) akan membawa sebuah warna dye yang berbeda. Dengan demikian semua fragmen yang diterminasi (yang berujung sebuah ddNTP), mengandung sebuah dye pada ujung 3′-nya (gambar 3).

Gambar 3: Satu Siklus Dye Terminator Cycle Sequencing


BigDye® Cycle Sequencing Chemistries

BigDye® primers dan terminators mengutilisasi molekul-molekul transfer energi tunggal, yang mencakup sebuah pewarna (dye) donor dan akseptor energi yang terhubung oleh sebuah penghubung (linker) transfer energi yang sangat efisien. Dalam struktur molekul BigDye®, akseptornya adalah sebuah dye dichlororhodamine. Dye dichlororhodamine (dRhodamine) merupakan suatu penyempurnaan atas dye rhodamine konvensional. dRhodamine terpisah lebih baik secara spektral — terdapat overlap spektral yang jauh lebih sedikit pada panjang gelombang eksitasi maksimumnya, dan produk sequencing yang dihasilkan memperlihatkan background noise yang jauh berkurang. Sehingga menghasilkan signal yang lebih bersih dan akurasi base calling yang lebih besar pada pembacaan yang lebih panjang. Suatu linker transfer energi meng-couple fluorescein donor dan dye dRhodamine akseptor untuk transfer energi yang efisien dalam satu molekul tunggal. Dye yang lebih terang dan bersih ini menghasilkan sebuah sequencing chemistry yang sesuai untuk kebanyakan aplikasi.

Pemurnian sample

Setelah reaksi sequencing, sangat penting untuk membuang dye terminators yang tidak menempel dan garam-garam yang dapat berkompetisi saat injeksi elektrophoresis kapiler. Terminator yang tidak menempel dapat turut bermigrasi bersama template sequencing, mengakibatkan basecalling errors dan kelebihan garam mengakibatkan rasio signal-to-noise menjadi buruk.

Elektroforesis

Pada proses elektroforesis kapiler, produk-produk reaksi cycle sequencing diinjeksikan secara elektrokinetik ke dalam kapiler yang diisi dengan polimer. Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif. Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif (gambar 4). Elektroforesis kapiler dapat memisahkan molekul DNA yang memiliki perbedaan bobot molekul hanya satu nukleotida.


Gambar 4: Fragmen DNA yang dilabel fluorescent bergerak melalui sebuah kapiler

















Gambar 5: Fragmen DNA melewati sebuah sinar laser dan detektor optis.

Beberapa saat sebelum mencapai elektroda positif, fragmen DNA terlabel fluorescent yang terpisah berdasarkan ukuran, bergerak melalui lintasan sinar laser. Sinar laser menyebabkan dye pada fragmen berpendar. Sebuah alat pendeteksi optis pada mesin DNA analyzer mendeteksi fluorescent (gambar 5). Software Data Collection mengkonversi signal fluorescent menjadi data digital, kemudian merekam datanya dalam sebuah file *.ab1. Karena masing-masing dye mengemisikan cahaya pada panjang gelombang yang berbeda ketika tereksitasi oleh laser, sehingga keempat warna yang mewakili keempat basa dapat dideteksi dan dibedakan dalam satu injeksi kapiler.

Analisa Data

Setelah elektroforesis, software Data Collection membuat sebuah file sample dari data mentah. Dengan menggunakan aplikasi software, analisa data selanjutnya diperlukan untuk menterjemahkan image data warna yang diperoleh menjadi basa-basa nukleotida yang berhubungan.

Analisa Primer

Tool-tool ini mengkonversi gambar yang diperoleh selama Data Collection menjadi empat warna, yang merepresentasikan keempat basa nukleotida yang berhubungan (gambar 1). Sebagai contoh, Software Sequence Analysis adalah perangkat analisa primer yang harus digunakan setelah pengumpulan data selesai. Aplikasi software Sequence Analysis memungkinkan pengguna untuk melakukan basecall dan basecall ulang, memotong ujung data, menampilkan, menyunting dan mencetak file-file sample. Software analisa primer memproses data mentah pada file *.ab1 menggunakan algoritma dan menerapkan pengaturan analisa berikut kepada hasil:

Basecalling

Basecaller yang dipilih memproses signal-signal fluorescent, kemudian menetapkan suatu basa kepada setiap peak (A, C, G, T, atau N). Jika digunakan KB™ basecaller, software ini juga menyediakan prediksi nilai kualitas per basa, basecalling campuran tambahan dan identifikasi otomatis sample-sample yang gagal.







Gambar 5: Fragmen DNA melewati sebuah sinar laser dan detektor optis.

Koreksi Pergeseran Mobility

File Mobility mengkompensasi perubahan dalam mobilitas fragmen DNA yang disebabkan oleh molekul dye yang terikat pada fragmen DNA dan mengubah penetapan warna basa-basa bergantung pada jenis chemistry yang digunakan untuk melabel DNA.

Quality Value (QV)

Jika menggunakan KB basecaller untuk analisa, software memberikan suatu QV untuk setiap basa. QV memprediksi probabilitas suatu galat basecall. Contohnya, suatu QV 20 memprediksi tingkat galat 1%. Algoritma pemrediksi kualitas dikalibrasi untuk memperoleh QV yang memenuhi hubungan standar-industri yang ditetapkan oleh software Phred. Jika alur kerja kita mencakup analisa menggunakan software Phred untuk memberikan QV setelah data di-basecall, kita dapat menyederhanakan workflow dan menggunakan KB Basecaller saja. KB Basecaller dapat melakukan basecalling dan memberikan QV. Kemudian, kita dapat membuat file *.phd.1 atau *.scf menggunakan KB Basecaller untuk diintegrasikan dengan workflow kita.

Analisa Sekunder

Tool-tool ini memungkinkan kita untuk lebih menyempurnakan hasil. Algoritma dalam produk-produk software analisa sekunder melakukan sejumlah aplikasi pendukung fungsi-fungsi seperti deteksi mutasi dan genotyping, dan menghasilkan output-output grafis.

Diterjemahkan dengan modifikasi dari situs www.appliedbiosystems.com